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1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了肥料中糞大腸菌群的測(cè)定方法

2 定義

下列定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)

糞大腸菌群 fecal coliforms

群在44.5℃±0.5℃條件能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌

糞大腸菌群數(shù)為每克(毫升)肥料樣品中糞大腸菌群的*可能數(shù)(MPN)。

3 儀器設(shè)備

高壓蒸汽滅菌器;顯微鏡;恒溫水浴或隔水式培養(yǎng)箱;恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床;干燥箱;天平;酸度計(jì)或精密pH試紙;接種環(huán);試管(15mm×150mm);小套管(杜蘭管);移液管、三角瓶、培養(yǎng)皿、載玻片、玻璃珠酒精燈、試管架。

4 培養(yǎng)基和試劑

4.1 培養(yǎng)基:遵照附錄A的規(guī)定

4.2 革蘭氏染色液:遵照附錄B的規(guī)定

5 檢驗(yàn)步驟

樣品稀釋

在無(wú)菌操作下稱取樣品10.0g或吸取樣品10mL,加入到帶玻璃珠的90mL無(wú)菌水中,置于搖床200r/min充分振蕩30min,即成0.1稀釋液

用無(wú)菌移液管吸取5.0ml上述稀釋液加入到45mL無(wú)菌水中,混勻成0.01稀釋液。這樣依次稀釋,分別得到0.001,0.0001等濃度稀釋液(每個(gè)稀釋度須更換無(wú)菌移液管)

5.2 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)

選取三個(gè)連續(xù)適宜稀釋液,分別吸取不同稀釋液1.0mL加入到乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi),每一稀釋度接種3支發(fā)酵管,置44.5℃士0.5℃恒溫水浴或隔水式培養(yǎng)箱內(nèi),培養(yǎng)24h±2h。如果所有乳糖膽鹽發(fā)酵

管都不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣,則為糞大腸菌群陰性;如果有產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸的發(fā)酵管,則按5.3進(jìn)行

5.3 分離培養(yǎng)

從產(chǎn)酸產(chǎn)氣或只產(chǎn)酸的發(fā)酵管中分別挑取發(fā)酵液在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上劃線,置36℃±1℃條件下培養(yǎng)18h~24h

5.4 證實(shí)試驗(yàn)

從5.3分離平板上挑取可疑菌落,進(jìn)行革蘭氏染色。染色反應(yīng)陽(yáng)性者為糞大腸菌群陰性;如果為革蘭氏陰性無(wú)芽胞杄菌則挑取同樣菌落接種在乳糖發(fā)酵管中,置4.5℃±0.5℃條件下培養(yǎng)24h±2h觀察產(chǎn)氣情況,不產(chǎn)氣為糞大腸菌群陰性;產(chǎn)氣為糞大腸菌群陽(yáng)性

5 結(jié)果

證實(shí)試驗(yàn)為糞大腸菌群陽(yáng)性的,根據(jù)糞大腸菌群陽(yáng)性發(fā)酵管數(shù),查MPN檢索表,得出每克(毫升)料樣品中的糞大腸菌群數(shù)

GB/T19524.1—2004 附錄A(規(guī)范性附錄)

培養(yǎng)基

A.1 乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基

蛋白胨 20.0g

豬膽鹽 5.0g

乳糖 10.0g

0.004%溴甲酚紫水溶液 25.0mL

蒸餾水 1000mL

PH值 7.2~7.4

制法:將蛋白胨豬膽鹽及乳糖溶解于蒸餾水中,校正pH,加入溴甲酚紫水溶液,然后分裝試管,每管9mL,并放入一支倒置的小套管,高壓滅菌115℃、15min。

注1:初發(fā)酵培養(yǎng)基

注2:糞大腸菌群細(xì)菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣使培養(yǎng)液由紫色變成黃色,套管內(nèi)充有氣體

A.2 伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基

磷酸氫二鉀(K2HPO4·3H2O) 2.0g

瓊脂 20.0g

2%伊紅Y水溶液 20.0mL

0.65%美藍(lán)水溶液 10.0mL

pH值 7.2~7.4

制法:將蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀溶解于蒸餾水中,校正pH,投入瓊脂并加熱溶解,分裝于三角瓶中,高壓滅菌115℃、15min備用。伊紅和美藍(lán)溶液分別高壓滅菌121℃、20min。臨用時(shí)加熱熔化培養(yǎng)基,冷卻至50℃~55℃,加入無(wú)菌的伊紅和美藍(lán)溶液,播勻傾注平板。

A.3 乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基

制法:將蛋白胨及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示劑,按檢驗(yàn)要求分裝3mL~5mL,并放入1支倒置的小套管,高壓滅菌115℃、15min。

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